吉玛烷型倍半萜内酯广泛的存在于菊科植物中，其主要结构特征为典型的十元环外，Δ1(10)和Δ4(5)位存在两个反式双键。这类成分被报道具有显著的抗肿瘤活性，例如小白菊内酯和泽兰内酯等。近日，宋少江教授课题组从地胆草中分离得到一系列吉玛烷型倍半萜内酯，通过多种波谱学手段，X-射线单晶衍射和量子计算化学的方法确定了它们的结构。此外，评价了它们对Hep3B和HepG2两种人肝癌细胞的抑制活性，并讨论了它们的构效关系。同时，对吉玛烷型倍半萜内酯进行了药理机制研究(Eur. J. Med. Chem.,2020, DOI:10.1016/j.ejmech.2020.112362)。
宋少江教授课题组在发现和寻找天然来源的肿瘤抑制剂方面做了一系列的工作(J. Nat. Prod.,2016,79, 2236−2242；J. Biol. Chem.,2014,289, 6394-6403;Eur. J. Med. Chem.,2017,138,212-220;Eur. J. Med. Chem.,2017,133, 1-10;Eur. J. Med. Chem.,2017,127, 62-71)。通过逐步形成的中药抗肿瘤的物质基础及作用机制评价体系快速发现天然来源肿瘤抑制剂先导化合物。
肝癌是一种常见的恶性肿瘤，每年的发病率和死亡率持续上升。为从传统中药中寻找新型的肝癌抑制剂，我们从地胆草中分离得到一系列的吉玛烷型倍半萜内酯，其中包括16个新化合物和1个已知化合物(Figure 1)。它们的结构通过多种波谱学手段，X-射线单晶衍射和量子计算化学的方法确定(Figure2-4)。
Figure 1.Compounds1-17isolated fromElephantopus scaber.
（来源：Eur. J. Med. Chem.）
Figure 2.Comparison of the experimental and calculated ECD spectra of1-8in MeOH. Spectra were calculated at theCAM-B3LYP/6-311++G (2d, p)//ωB97X-D/6-31G(d)level.
（来源：Eur. J. Med. Chem.）
Figure 3.The ORTEP drawing of1,3,8,14, and15
（来源：Eur. J. Med. Chem.）
Figure4.Comparison of the experimental and calculated ECD spectra of9-16in MeOH. Spectra were calculated at theCAM-B3LYP/6-311++G (2d, p)//ωB97X-D/6-31G(d)level.
（来源：Eur. J. Med. Chem.）
通过分析化合物对两种肝癌细胞的抑制实验结果，发现化合物7-10具有比阳性药（索拉菲尼）显著的活性（IC50值1.98到5.99μM），化合物1，2，17展示出与索拉菲尼相近的活性。通过比较化合物的结构与活性，我们对吉玛烷型倍半萜内酯抑制肝癌活性的构效关系进行初步总结：环外α,β-不饱和酮和8位的酯侧链对于细胞毒活性十分关键，而2位的构型对于活性并无太大影响(Figure5)。
Figure5.Structure-activity relationships of germacranolide sesquiterpenes against Hep3B and HepG2 cells.
（来源：Eur. J. Med. Chem.）
接下来，我们对活性最好的化合物10进行了药理机制研究。凋亡是细胞死亡的一种常见机制，在调节肿瘤的发生发展中起到重要作用。因此，我们考查了化合物10对Hep3B和HepG2两种肝癌细胞是否通过细胞凋亡的方式来发挥细胞毒作用的。通过Hoechst染色，Annexin-V-PI，Caspase-3活性测定试剂盒和Western blot实验，表明10可显著诱导Hep3B和HepG2细胞凋亡，同时激活Hep3B和HepG2细胞中的caspase-3的活性(Figure6)。
Figure6.Compound10causes apoptotic cell death in Hep3Band HepG2 cells. (A) The cells were observed with a phase contrast microscope.(B)The nuclear morphology of Hep3Band HepG2cells was visualizedthrough Hoechst 33258 staining.(C) The percentage of apoptotic cells was analyzed through the Annexin V-PITC/PI assay after cells were treated with10for 48 h.(D)Measurement of caspase-3 activity in the Hep3B and HepG2 cells.(E)Theexpressionof FADD, Bax,Bcl-2,cl-caspase3, PARP and cl-PARP were determined by Western blot analysis. β-actin was used as a loading control.*p< 0.05, **p< 0.01, **p< 0.001,#p< 0.001vs control group.
（来源：Eur. J. Med. Chem.）
采用H2DCFH-DA染色法，证明化合物10可以能够时间依赖性的提高两种肝癌细胞中的活性氧的水平。JC-1染色实验证明10可以浓度依赖性的降低两种肝癌细胞的膜电位(Figure7)。
Figure7. (A)Compound10promoted ROS generation in Hep3Band HepG2cells. (B) MMP was determinedby JC-1 staining. *p< 0.05, **p< 0.01, **p< 0.001vs control group.
（来源：Eur. J. Med. Chem.）
细胞自噬和异常的细胞周期阻滞同样在抑制肿瘤细胞中起到关键作用。细胞自噬是一种在真核细胞中普遍存在的高度保守的自我消化现象，参与生存反应和抗肿瘤过程；细胞周期过程是一个连续的、完整的生理过程，当缺乏适当信号，细胞无法从一个阶段进入到下一个阶段时，该现象称为细胞周期阻滞，可以有效的抑制肿瘤细胞生长。MDC染色流式细胞术和PI染色法实验结果证明，10也可以导致Hep3B和HepG2细胞自噬和G2/M期细胞阻滞(Figure8)。
Figure8.AutophagyandG2/Mphase arrest weretriggered in10-treated Hep3Band HepG2cells. (A) The autophagic cellswere observed by flow cytometricanalysis of MDC positive ratio. (B)Cell cycle distribution was detected by flow cytometry after treatment intwocancer cells.*p< 0.05, **p< 0.01, **p< 0.001vs control group.
（来源：Eur. J. Med. Chem.）
丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是一类典型的蛋白激酶，可介导细胞增殖、基因表达、细胞存活和凋亡等几个基本的细胞过程。它包含三个主要成员:p38-丝裂原活化蛋白激酶(p38)，c-Jun N-末端激酶(JNK)，细胞外调节蛋白激酶(ERK)。我们考察了化合物10对MAPKs信号通路中相关蛋白的磷酸化水平的影响。Western blot检测MAPKs相关蛋白的结果表明HepG2细胞中p-p38、p-JNK和p-ERK水平呈剂量依赖性升高。PI3K / AKT通路是肿瘤过程中重要的信号通路，这一途径与肿瘤的发生、发展和耐药性有关。考察化合物10对PI3K / AKT信号通路中相关蛋白的磷酸化水平的影响，结果表明10以剂量依赖的方式降低了HepG2细胞中p-Akt的表达。因此，MAPKs和AKT信号通路在化合物10诱导HepG2细胞死亡的过程中起重要作用(Figure9)。
Figure9.Effects of p38/JNK MAPKand AKT pathwayson apoptosis induced by10in HepG2cells. (A)The expressionlevels ofp-p38, p-JNK and p-ERKwere detected by Western blot.(B)The expressionlevels ofAKT and p-AKTwere detected by Western blot.β-actinwas usedas a loading control.*p< 0.05, **p< 0.01, #p< 0.001vs control group.
（来源：Eur. J. Med. Chem.）
该工作以"Elephantopinolide A-P,germacrane-type sesquiterpene lactonesfromElephantopus scaber induceapoptosis,autophagy and G2/Mphase arrest in hepatocellular carcinoma cells"为题发表在Eur. J. Med. Chem.,(DOI: 10.1016/j.ejmech.2020.112362)，第一作者为沈阳药科大学博士生白明和硕士生陈靖杰。通讯作者为沈阳药科大学宋少江教授，黄肖霄教授和姚国栋副教授。该工作获得了国家自然科学基金（No.81903511）沈阳药科大学中青年教师事业发展支持计划（No. ZQN2018006）和辽宁省创新团队（No. LT2015027）的资助。